Colorações Especiais Básicas

 Os cortes de tecidos devem ser corados para que possamos distinguir mais facilmente as diferentes estruturas celulares que têm o mesmo grau de refringência, portanto indistinguíveis quando observadas ao microscópio óptico.

Os corantes dividem-se quanto à origem em naturais (de origem animal ou vegetal) e artificiais (compostos orgânicos da série aromática) obtidos por síntese de corpos extraídos da hulha.
Quanto à natureza química os corantes classificam-se em ácidos, básicos e neutros.

Os básicos (derivados da anilina) são sais cujos radicais são alcalinos, ou seja, coram os tecidos de natureza ácida (ditos basófilos), como os ácidos nucléicos – DNA e RNA – polissacarídeos sulfurosos, polissacarídeos dos ácidos urônico e siálico, e proteínas que contêm mais radicais do grupo carboxílico do que do grupo amino.

Os corantes ácidos são sais que apresentam predomínio de ânions (sulfonato ácido de Na e K ou um ácido carboxílico). Coram os tecidos de natureza alcalina que são constituídos na sua maior parte por proteínas que contém um excesso de aminoácidos alcalinos – arginina, lisina, hidroxilisina e histidina.

Nos corantes neutros o ânion e o cátion encontram-se corados como por exemplo o picrato do azul de metileno.

Há ainda os corantes ditos indiferentes que não são ácidos nem básicos nem possuem a capacidade de formar sais. São geralmente insolúveis na água, mas solúveis no álcool, éter e óleos, por exemplo os corantes das gorduras: Sudão III.

Colorações nucleares: hematoxilina

É uma substância cristalina, incolor ou ligeiramente amarelada extraída do pau de Campêche (Haematoxylon compechianum), leguminosa arborescente da América central. Esta substância pode não ter qualquer poder de coloração, mas após oxidação transforma-se em hemateína. A hemateína é a substância ativa nas soluções de hematoxilina necessitando de um mordente com o qual forma uma laca (sal) para que assim possa corar os tecidos.

A base utilizada que serve de mordente pode ser o alumínio ou então um sal de cobre, de ferro, de cromo, de tungstênio, etc, obtendo-se com todos eles uma excelente coloração nuclear.

A hematoxilina e a hemateína são solúveis no álcool e na glicerina. A hemateína é pouco solúvel na água ao contrário da hematoxilina.

Existem várias fórmulas de soluções de hematoxilina podendo utilizar-se um método regressivo (por ex. com a hematoxilina de Harris), ou um método progressivo (hematoxilina de Mayer).

No método regressivo coram-se todas as estruturas tissulares (núcleos, citoplasma tecidos conjuntivos, etc.) efetuando-se depois uma descoloração controlada até atingir uma coloração nuclear adequada. No método progressivo só cora-se o núcleo. A intensidade de azul obtem-se lavando as lâminas em água corrente.

Colorações citoplasmáticas: eosinas

Derivadas da bromofluoresceína, as eosinas são sais de sódio ou de potássio. A sua cor depende sobretudo do número de átomos de bromo fixados ao núcleo da fluoresceína. As eosinas utilizadas em colorações são derivadas da tetrabromo-fluoresceína, que apresentam fluorescência e tons amarelados ou azulados, são solúveis na água e no álcool.
As eosinas dão colorações difusas, mas quando utilizadas com cuidado consegue-se obter uma gama de tons que varia do rosa muito claro até ao rosa vivo.
A eosina amarela em solução aquosa a 2% é a mais utilizada nas colorações em conjunto com a hematoxilina. O tempo de coloração varia segundo o tecido a corar e o grau de diferenciação que se pretende, pode variar entre 1 a 7 minutos.

Coloração do glicogênio e mucopolissacarídeos – PAS (periodic acid-Schiff)

É uma técnica de coloração muito útil e esteticamente agradável, substituindo em alguns laboratórios a coloração de rotina (HE). Esta técnica dá uma reação positiva com todos os polissacarídeos complexos, o que inclui o glicogênio, ácido hialurônico, mucoproteínas, glicoproteínas, glicolipídeos e fosfatídeos. Assim, serve para demonstrar/detectar o glicogênio, mucinas neutras, membranas basais e evidenciar a maior parte de fungos e parasitas.
Resultados: núcleos azuis, substâncias PAS positivas de vermelho a rosa.

Coloração das fibras do tecido conjuntivo

Existem algumas colorações para demonstração dos tecidos conjuntivos, a maioria cai na categoria das colorações tricrômicas. O termo coloração tricrômica é o nome geral para técnicas que evidenciam o músculo, fibras de colágeno, fibrina e eritrócitos. São utilizados três (3) corantes um dos quais é usado como corante nuclear. Uma das colorações mais antigas é o método de van Gieson, com a qual os núcleos ficam azuis escuros a pretos, cartilagem azulada, o colágeno vermelho (fibras de colágeno e membranas basais) e os outros tecidos amarelos (fibras elásticas, citoplasma das células epiteliais e musculares).
Uma outra coloração tricrômica muito utiliza é a coloração de Masson, com esta técnica, os núcleos ficam azuis escuros ou pretos, o músculo, os eritrócitos e o citoplasma das células vermelhos e o colágeno azul.

Colorações argentafins e argirofilicas

A reação argentafim depende da presença no tecido de substâncias, freqüentemente do grupo fenólico (tais como catecolaminas ou indolaminas), que reduzem os sais de prata (e outros metais) – Fontana-Masson.
Nas reações argirofilicas é adicionado um agente redutor externo tal como a hidroquinona ou a formalina – Grimelius. Nos dois tipos de colorações obtêm-se grânulos castanhos escuros ou negros e para os demais tecidos a cor depende do corante de contraste utilizado. Estas colorações são utilizadas para detectar células neuroendócrinas e melanina.

Coloração da substância amilóide

A coloração com Vermelho do Congo é seguida pela observação com luz polarizada. É a técnica mais prática para detectar a substância amilóide. A coloração não tem nenhuma especificidade química, estando dependente da disposição das moléculas. Nesta técnica a substância amilóide, o tecido elástico e os grânulos eosinofílicos ficam vermelhos, enquanto que os núcleos ficam azuis. Estas preparações quando observadas com luz polarizada apresentam birrefringência exibindo uma cor verde maçã para a substância amilóide.

Pigmentos e minerais

Nos tecidos podemos observar alguns pigmentos que devem ser caracterizados para determinar a patologia em questão, dentre os vários pigmentos destacamos a melanina, a hemossiderina, a lipofuscina e nos minerais o cálcio.
Na reação de Perls para a hemossiderina, o ácido hidrocloridrico separa a proteína do ferro permitindo que o ferrocianido de potássio se ligue ao ferro na forma férrica e que se forme o ferrocianido férrico (azul da Prússia). Assim, os tecidos com hemossiderina e alguns óxidos e sais de ferro ficam azuis.

No método de Fontana–Masson para a melanina é utilizada uma solução de prata amoniacal sem banho redutor. Apenas as substâncias capazes de reduzir diretamente os sais de prata tais como a melanina são evidenciadas. No final os grânulos argentafins e a melanina ficam de cor negra enquanto os núcleos e o citoplasma variam de rosa a vermelho.

As lipofuscinas são uma mistura heterogênea de pigmentos nos quais se incluem os ceroides. Existem algumas técnicas que nos permitem evidenciar de alguma forma estes pigmentos, destacamos o método de Sudam negro B que deixa o pigmento negro e o método de Zielh-Neelsen modificado ficando as lipofuscinas de cor margenta.
No método de von Kossa para o cálcio, sais de prata são reduzidos para prata metálica negra pelo uso de luz ou de um revelador fotográfico, obtendo-se no final os sais de cálcio de cor negra.

No entanto, não devemos esquecer que pigmentos por artefato podem surgir e que devem ser distinguidos dos pigmentos acima referidos. O mais freqüente é o pigmento de formol que surge sob a forma de um depósito castanho ou preto nos tecidos fixados em formalina cujo pH é inferior a 6.5. Quando a fixação é muito prolongada os tecidos fixados em formalina neutralizada acabam por exibir este pigmento. A forma de contornar este artefato é extrair o pigmento da preparação antes de aplicar a coloração escolhida.

Colorações para microorganismos

Nestas técnicas incluem-se as técnicas para as bactérias gram-positivas e gram-negativas, micobactérias álcool ácido-resistentes, fungos e parasitas.
A coloração de Gram permite a separação das bactérias em gram-positivas, que retêm os complexos de cristal de violeta-iodina e em gram negativas, que são descoradas pelo álcool ou acetona e coradas pela safranina ou fucsina (corantes de contraste). No final obtemos as bactérias gram-positivas azuis escuras e as gram-negativas vermelhas.

O fundamento da técnica de coloração de Ziehl-Neelsen baseia-se na capacidade que alguns microorganismos reterem os corantes complexos básicos (tais como arbolfucsina) após forte descoloração com ácido-álcool. A resistência aos ácidos depende do elevado conteúdo em lipídeos (ácidos micólicos e ácidos graxos de cadeias longas) das paredes celulares das micobactérias.

A técnica de PAS, já referida é muito utilizada para evidenciar fungos, no entanto quando estão em pequena quantidade é preferível optar pelo método de Grocott. O método de Grocott permite-nos evidenciar fungos e leveduras. O método baseia-se na redução da prata pelos grupos aldeídos resultantes da oxidação pelo ácido crômico. No final os fungos são marcados de cor negra. É o método de eleição para detecção destes microrganismos principalmente quando o seu número é diminuto.

Na demonstração de protozoários a técnica mais popular é a coloração de Giemsa, com este método os protozoários e outros microorganismos ficam corados de azul escuro, enquanto que o fundo fica rosa ou azul claro, os núcleos ficam azuis.

Cortes por congelação

Os cortes por congelação são utilizados para diagnósticos rápidos, no estudo de gorduras e substâncias lipídicas que se perdem quando utilizamos os métodos de parafina.

Coloração de gorduras

As técnicas que permitem a detecção de gorduras são limitadas visto não poderem ser aplicadas em material incluído em parafina, pois as gorduras se dissolverem no xilol ou nos outros materiais usados no processamento, portanto, limitando a sua aplicação aos cortes de congelação.
A técnica de sudão negro B cora os ésteres de colesterol e os triglicerideos de azul escuro e alguns fosfolipideos de cinza.