É uma técnica que permite a visualização de antigenos nos tecidos ou em suspensões celulares, utilizando corantes fluorescentes, que são corantes que absorvem luz e emitem a sua própria luz num determinado comprimento de onda.
Quando o corante está ligado ou conjugado com um anticorpo, os locais de reação entre o antigeno e o anticorpo conjugado, podem facilmente ser visualizados. Os fluorocromos mais utilizados em técnicas de imunofluorescência são a fluoresceína isocianetada (FITC) e rodamina. Esses corantes absorvem luz que não é visível para a vista humana (ultravioleta), e emitem luz que é visível.
Tipos
IFD – Envolve a aplicação de anticorpos fluoresceinados a secções congeladas de pele.
Determina a deposição de Antígenos no tecido do paciente
IFI – Usa tecido normal como substrato, com o qual o soro do paciente é incubado seguido da aplicação dos Acs fluorescentes.
Detecta autoanticorpos circulantes.
Através da imunofluorescência direta pode se detectar anticorpos, principalmente IgG, IgG combinada com C3, IgA e IgM nos espaços intercelulares.
Na técnica de imunofluorescência indireta, um fragmento de pele normal (animal ou humana) é incubado com o soro do paciente com suspeita de PV, por exemplo, e adiciona-se anti-anticorpo humano conjugado com a fluoresceína. A positividade presente no tecido indica a existência de anticorpos circulantes.
IFD EM DOENÇAS VESICOBOLHOSAS – Detecta moléculas como anticorpos e frações do complemento em espécimes de biópsia.
Local da biópsia: pele perilesional.
IFI – Confirma o diagnóstico e por vezes é útil na diferenciação.
DOENÇAS BOLHOSAS
GRUPO DOS PÊNFIGOS
Acs contra proteínas desmossômicas.
O Ac de cada tipo é dirigido contra uma única proteína ou combinação específica.
DOENÇAS VESICULOBOLHOSAS SUBEPIDÉRMICAS
Anticorpos contra a Mb, ativando o processo inflamatório.
Há um sobreposição clínica e histológica nestas doenças.
* Local de deposição imune,
* Classes de Ig ou complemento depositados,
* Padrão e intensidade do depósito,
* Deposição em outros locais além do principal.
Parâmetros para diagnóstico do subtipo de Pênfigo:
Classe de Ig depositada
Relativa intensidade nos diferentes níveis epidérmicos
Outros padrões de deposição associados.
Padrões de fluorescência nos Pênfigos
IgG no espaço intercelular: é o padrão mais característico de todos os tipos, exceto pênfigo por IgA.
O depósito pode ocasionalmente ser limitado ou mais intenso no local de clivagem – formação da bolha, mais alto no PF e mais baixo no PV (distribuição do antígeno)
C3 pode ser visto, com freqüência e geralmente em intensidade mais baixa.
IgG no espaço intercelular e MB: pode ser visto no PNP, que também tem Acs contra a MB.
O diagnóstico diferencial é clínico e histológico.
IgA no espaço intercelular: padrão característico do Pênfigo por IgA (Dermatose Pustular Subcórnea com IgA intercelular / Dermatose Neutrofílica Intra-Epidérmica com IgA intercelular)
Valor preditivos da IMF nos pênfigos:
POSITIVO – Próximo de 100%
NEGATIVO – 85 – 90%
Falso negativo pode resultar de erro técnico (biópsia de área lesada / Diluição inadequada do anti-soro / painel limitado)
Verdadeiro negativo–Raros casos de Pênfigo induzido por drogas (10%)
Biopsiar novamente se o diagnóstico histológico é de Pênfigo.
Deposição na Membrana Basal
É o padrão mais característico das Dermatoses Bolhosas Subepidérmicas
Deposição de IgG e/ou C3: padrão visto no BP, CP, HG, EBA e Lupus Bolhoso.
Deposição de C3 com padrão linear mais intenso que IgG favorece o grupo do Penfigóide; não é incomum C3 ser o único depósito.
Se IgG for mais intenso favorece EBA.
Depósitos múltiplos: favorece EBA e LE bolhoso.
A EBA mostra intensa deposição de IgG em padrão linear, C3 em menor intensidade, IgA (60%), IgM (30%).
O padrão granular favorece LE Bolhoso (60% dos casos indistinguível).
Diferenciação precisa requerer correlação clínica e sorológica).
Deposição de IgA e/ou C3 – Característica de Dermatose por IgA linear.
Deposição de C3 ocorre menos freqüentemente e com intensidade mais baixa.
IMF usando a técnica de Salt-Split:
Os achados clínicos, histológicos e imunológicos podem ser inconclusivos para diferenciar BP x EBA.
DEPOSIÇÃO DO BP: Lâmina lúcida (BP180).
DEPOSIÇÃO da EBA > Sublâmina densa (COL. VII).
Pele + Sol. Salina 1MOL (72h) Clivagem na parte inferior da lâmina lúcida IFD.
IMF usando a técnica de Salt-Split:
PADRÃO EPIDÉRMICO – BP
PADRÃO DERMOEPIDÉRMICO – BP
PADRÃO DÉRMICO – EBA
A mesma reação pode ser feita de forma indireta, usando como substrato pele humana normal.
Deposição na Membrana Basal e Vasos
É o padrão característico das Porfirias
As Igs mais freqüentes são IgG e IgA
C3 às vezes está presente
Deposição nas papilas dérmicas
IgA e C3 (50%) em padrão granular nas papilas dérmicas é achado diagnóstico de Dermatite Herpetiforme.
Deposição de IgA está presente em 100% dos casos, com amostragem adequada
Valor preditivo em Doenças Bolhosas Subepidérmica:
positivo e negativo – positivo a 100%
Falso negativo pode ocorrer por erro técnico ou amostra inadequada (àrea inflamada ou bolha).
CONCLUSÕES
Há uma sobreposição entre os aspectos clínicos e histológicos de várias doenças bolhosas auto-imunes.
IMF é extremamente útil para confirmar um caso suspeito e distinguir entre doenças relacionadas.
Um diagnóstico acurado é útil na escolha da terapia e manejo dos pacientes com doenças bolhosas.
TÉCNICA IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Os conjugados de Fluorescência são obtidos comercialmente de diversas marcas.
As reações desenvolvidas neste serviço são: IgA, IgG, IgM, C3c, C1q, Kappa, Lambda e Fibrinogênio.
1. Após a reconstituição com água destilada, dividir em alíquotas de 50 ml e conserva-las em freezer a -20 C.
2. Preparar a solução de PBS
Cloreto de Sódio…………………..8,0 g
Cloreto de Potássio…………….0,81 g
Fosfato de Sódio(Na2HPO4)……….1,15 g se Na2HPO4 12H2O: 2,42 g
Fosfato de Potássio(KH2PO4)…….0,20 g
Dissolver em 1000 ml de água destilada e medir o pH
3. Preparar a solução Azul de Evans / PBS
Azul de Evans………………….0,01 g
Solução de PBS……………..100 ml
4. Rediluir a solução de Azul de Evans/PBS
Solução Azul de Evans/PBS………..10 ml
Solução PBS……………………………….90 ml
Filtrar esta solução
5. Separar das alíquotas uma amostra de cada para uso e acrescentar aos 50 ml mais 1 ml de solução de Azul de Evans/PBS rediluido(4) e conservá-las em geladeira a +4 C
6. As biópsias são incluídas em Tissue- TeK, congeladas em Nitrogênio Líquido e cortadas em criostato a -24 C.
7. Os cortes colhidos em lâminas silanizadas e secos ao ar são acomodadas em uma cuba e imersas em PBS por 15 minutos.
8. Colocar o conjugado rediluido: IgA-IgM-IgG-C3c-C1q-Kappa-Lambda-Fibrinogênio em centrífuga e centrifugar por 15 minutos com 9000 RPM (na hora do uso).
9. Incubar em câmara úmida por 30 minutos a temperatura ambiente
10. Lavar cuidadosamente os cortes, escorrendo sobre eles a solução de PBS .
11. Mergulhar na solução de PBS por 10 minutos e repetir mais 10 minutos com nova solução.
12. Montar com lamínula sob solução PBS/glicerina na proporção 1/2
Fonte: site da UNICAMP texto produzido pelo Prof. Luciano de Souza Queiroz no endereço eletrônico: http://anatpat.unicamp.br/tecnicashistologicas.html
IMUNOPATOLOGIA DAS COLAGENOSES E VASCULITES
LUPUS ERITEMATOSO
IMF é útil para confirmar o diagnóstico quando suspeitado clinicamente, histologicamente ou ambos.
Pode ser útil para distinguir entre os subtipos de LE desde que a freqüência de deposição, morfologia e local variem.
Ajuda no diferencial com doenças com achados clínicos e histológicos similares.
LUPUS ERITEMATOSO DISCÓIDE
Os depósitos imunes são caracteristicamente encontrados ao longo da junção dermoepidérmica em padrão granular.
Corpos citóides podem ser vistos
Depósitos mais freqüêntes são IgG e IgM.
A freqüência de imunodepósitos depende do local da biópsia, tratamento prévio e duração da lesão:
Pele Lesada – 60-94%
Pele não Lesada – Negativo
Os depósitos imunes na MB podem ser vistos em outras colagenoses, rosácea, hepatite crônica ativa, cirrose biliar ou pele normal fotoexposta.
Combinação de IgG + IgM favorece LE, sendo IgG mais específica.
Para confirmar LED: lesão antiga, não tratada, em área não fotoexposta.
LUPUS ERITEMATOSO SUBAGUDO
Os depósitos imunes podem estar presentes na MB e núcleos de queratinócitos.
Corpos citóides podem ser vistos.
Um padrão único para a forma subaguda é a fluorescência granular nos núcleos dos queratinócitos basais (anti-RO e LA).
PELE LESADA – 54%-100%
PELE NÃO LESADA – 18-100%
LUPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
Os depósitos imunes podem estar presentes em quatro locais: MB (Banda Lúpica), corpos citóides na derme papilar, parede de vasos e núcleos de queratinócitos.
85% têm depósitos granulares múltiplos na MB principalmente IgG e IgM, com ou sem C3 (45%).
IMUNOPATOLOGIA DAS COLAGENOSES E VASCULITES
A prevalência de deposição de Ig e complemento depende do aspecto clínico da lesão, local da biópsia, tratamento prévio e atividade da doença.
PELE LESADA – 50-100%
PELE NÃO LESADA:
* FOTOEXPOSTA: 73-90%
* NÃO FOTOEXPOSTA: 68-92%
VALOR PREDITIVO DA IFD EM PELE LESADA
POSITIVO – 64%
NEGATIVO – 98%
RESULTADO NEGATIVO VIRTUALMENTE EXCLUI LE.
IMUNOPATOLOGIA DAS COLAGENOSES E VASCULITES
Doença mista do tecido conjuntivo.
A IMF é frequentemente positiva e tem padrão característico: depósitos nos núcleos dos Queratinócitos (40% – 100%) e na MB (15%).
Os depósitos nucleares são característicos mas não diagnósticos:
LES – 10-15%
SS – 20%
ESCLERODERMIA
IMF negativa ou não específica
Depósitos de IgM na MB, depósitos vasculares (15%) e nucleares (similar a DMTC) podem ser vistos.
IMF é de pouco valor diagnóstico.
DERMATOMIOSITE
Depósito ao longo da MB, por vezes com corpos citóides, semelhante ao LE (50%)
Os depósitos imunes mais freqüentes são IgM, IgG e C3.
Fluorescência fraca ou negativa favorece DM.
Fluorescência forte e depósitos nucleares favorecem LE.
IMF pode ser útil para confirmar VLC e mais especificamente o diagnóstico de púrpura de Henoch-Scholein.
O sítio dos depósitos é a parede dos vasos da derme superficial e o achado mais freqüente e C3, seguido de IgG e IgM.
Lesões com < 24 horas tem maior freqüência de resultados positivos.
A presença de depósitos não é diagnóstica isoladamente e o achado negativo não afasta.
Púrpura Henoch-Scholein.
Forma de vasculite com envolvimento sistêmico (TGI, renal e articular) em crianças.
Depósito de IgA nos vasos é característico.
A taxa de positividade é variável dependendo da duração da lesão (75%-100%).
IFD EM OUTRAS DOENÇAS
Nos casos não característicos pela clínica e histologia, IMF pode ser útil no diferencial com LE e Penfigóide cicatricial.
Depósitos globulares na derme papilar, principalmente de IgM.
O padrão é inespecífico e pode ser visto em outras condições: LE, GVHD, Líquen Escleroso, Eritema Multiforme, Amiloidose, pele normal.
Aspectos que favorecem Líquen Plano: depósitos em grupos, em alto número, grandes, intensos e múltiplos.
